二级生物安全柜是为4级实验室生物安全等级而设计的，是目前世界上高安全防护等级的安全柜。柜体*气密，100%全排放式，所有气体不参与循环，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手套箱(Golve box)，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适用于高风险的生物试验。
在允许循环化学气体的操作条件下，可以使用外接排放管道盖（Exhaust Collar）的A2型二级生物安全柜。排放管道盖与一般硬管不同的是有可吸入空气的进气孔；排放管道盖与外排管道连接，然后接到一个外排风机。排放管道盖上的进气孔对于A2型二级生物安全柜通过内置风机保持进气流和下沉气流的平衡至关重要。如果使用密封的外接风管，进气流将会过强可能导致安全柜对产品的保护实效；而排放管道盖上的进气孔可以从室内吸入空气，而不会影响安全柜内的气流平衡。此条件只适用于微量有毒化学物质。
如果不允许循环化学气体，则必须使用装备硬管的B2型二级生物安全柜。由于B型安全柜不是独立平衡系统，它的内置风机只能制造下沉气流，安全柜依赖外排风机制造进气流。这种型号的安全柜在安装和维护时会较为复杂，因为外排风机必须与内置风机保持平衡，否则将导致对操作人员或产品的安全性能的失效。
生物安全柜广泛应用在医疗卫生、疾病预防与控制、食品卫生、生物制药，环境监测以及各类生物实验室等领域，是保障生物安全和环境安全的重要基础，属于“民生”计量的范畴。早在30年前，生物安全柜检测已经在国外开展，目前主要依据欧盟或美国的标准。在国内，目前还没有统一的生物安全柜检测国家标准，生物安全柜检测方法十分混乱，既有建设部的标准，又有药监局的标准，还有采用欧盟标准、美国标准或各生产厂的企业标准的。